化妆品中霉菌和酵母菌总数的不确定度评定

吴卫玲1,2,王 荣1,3,葛晴颖1,3,姚思婷1,3,朱振华1,鞠慧萍1,3

(1.苏州出入境检验检疫局,江苏 苏州 215104;2.苏州世标检测技术有限公司,江苏 苏州 215104;3.苏州华博日化品检测服务有限公司,江苏 苏州 215104)

摘 要: 为确保化妆品中霉菌和酵母菌总数检测结果的精确度,依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)对乳液中霉菌和酵母菌总数进行检测,检测结果进行不确定度的评定。结果表明,霉菌和酵母菌总数检测结果的扩展不确定度为0.07,当样品中霉菌和酵母菌总数检测结果以平行样对数值的平均值表示时,其取值区间为2.54±0.07。研究中建立的不确定度评定方法可适用于化妆品的合格性判断。

关键词:化妆品;霉菌;酵母菌;不确定度;乳液

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值分散性,与测量结果相联系的参数[1]。为考察实验室质量,需进行不确定度评定。GB/T 27025-2008《检测和校准实验室能力的通用要求》[2]和CN1SCL 09:2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》[3]均提出:对测量结果应进行适当的不确定度评估。霉菌和酵母菌总数是考察化妆品质量问题的重要指标之一,被霉菌污染的化妆品,会产生霉斑;若被酵母菌污染则会导致化妆品出现变色、分层和浑浊等现象[4]。化妆品中霉菌和酵母菌总数检测采用平板计数法时,实验过程包含诸多不确定因素。本文实验在同一相对恒定试验条件下,在同一时间段内,由同一位检测人员应用同一批次的培养基和试剂,对同一批样品进行15次霉菌和酵母菌总数检测,并对检测结果进行不确定度评定。

1 实验部分

1.1 试剂

委托样品中经检测带菌的水溶性乳液样品。氯化钠,国药集团化学试剂有限公司;虎红培养基,北京路桥技术有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 原理

严格按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)[5]中规定的方法进行取样。在同一相对恒定实验条件下,同一位实验人员对同一批次的乳液样品进行15次重复检测,对检测结果进行不确定度评定。实验样品为均匀并含可计算得出霉菌和酵母菌总数的乳状化妆品(乳液)。

1.2.2 检测

称取10 g样品,加到装有玻璃珠及90 mL灭菌生理盐水的三角瓶中,充分振荡混匀,静置15 min,取其上清液作为1∶10检液。

用灭菌吸管吸取1∶10稀释的检液2 mL,分别注入到2个灭菌平皿内,每皿1 mL。另取1 mL注入到9 mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面),更换1支吸管并充分混匀,制成1∶100检液。吸取2 mL,分别注入到2个灭菌平皿内,每皿1 mL。另取1 mL 1∶100检液注入到9 mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面),更换1支吸管并充分混匀,制成1∶1 000检液。吸取2 mL,分别注入到2个灭菌平皿内,每皿1 mL。每个稀释度应换1支吸管。

将融化并冷至(45±1) ℃的虎红培养基充分摇匀。凝固后,翻转平板,置(28±2) ℃培养5 d,观察并记录。另取一个不加样品的灭菌空平皿,加入约15 mL虎红培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置(28±2) ℃培养箱内培养5 d,为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 数学模型的建立

在1∶10,1∶100和1∶1 000 3个稀释度中只有1个稀释度的平板菌落数在5~50 CFU间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,建立数学模型:X=1×K。以10倍稀释液报告,则,所以K=(V+m)/m

式中,X为样品中霉菌和酵母菌总数(CFU/g);1为某一稀释度平板上生长的霉菌和酵母菌平均菌落数(试验采用1∶10稀释度);K为选择的稀释倍数(试验中K为10);V为用于稀释液的无菌生理盐水的体积(mL,试验中V=90 mL);m为称取待检样品的质量(g,试验中m=10 g)。

2.2 不确定度来源的确定与分析

整个试验由同一检测人员对同一批次的乳液样品进行15次重复检测,检测步骤主要包括样品称量、稀释、均质、加样、混匀、培养、平皿计数和结果修约等。检测试验的不确定度主要来源于样品的均一性、样品的称重、定容体积、稀释、培养条件和重复性检测。由于在相同的无菌环境下重复检测试验,之后在相同的培养条件下进行培养,对来源于培养基、培养条件、操作人员操作技能等不便计算的不确定度忽略不计,所以仅对称量、稀释和重复性检测所引起的不确定度进行分析。

2.2.1 称取样品产生的标准不确定度

在无菌条件下,试验采用精度为0.01 g的电子天平称取10.00 g样品,所以此处只考虑天平本身引入的不确定度评定。根据JJG 1036-2008《中华人民共和国国家计量检定规程电子天平》的规定[6],该准确级(II)的天平在0~500 g称量范围的最大允许误差为±0.5 g,假定为均匀分布,样品称量引入的不确定度

2.2.2 样品稀释过程产生的标准不确定度

第1步 1∶10稀释:样品10.00 g于含有玻璃珠及90 mL无菌生理盐水的三角瓶中,制成1∶10稀释液。生理盐水采用100 mL量筒移取,根据JJG196-2006《中华人民共和国国家计量检定规程常用玻璃量器》[7]规定:100 mL量筒容量允误差为±1.0 mL。假定为三角形分布,量筒引入的不确定度

第2步 1∶100稀释:使用1 mL移液器和10 mL分度吸量管进行梯度稀释。用1 mL无菌移液器吸取1∶10样品匀液1 mL,沿管壁慢慢注入盛有9 mL(用10 mL无菌移液管吸取)无菌生理盐水中,制成1∶100样品匀液。根据JJG 646-2006《中华人民共和国国家计量检定规程移液器》[8]规定:23 ℃时1 000 μL可调移液器,容量允许误差为±1.0%,假定为三角形分布,1 mL移液器20 ℃时吸取1 mL不确定度:根据JJG196-2006《中华人民共和国国家计量检定规程常用玻璃量器》规定:1级单标10 mL分度吸量管,容量允许误差为±0.05 mL,假定为三角形分布,。因此

第3步 1∶1 000稀释是重复第2步稀释,引入的不确定度

试验在20 ℃条件下进行,忽略移液器、移液管等的操作温度与校准时温度不同而引起的不确定度。若溶液温度不为20 ℃时,必须考虑温度对体积的影响。样品稀释过程引入的不确定度

2.2.3 样品重复检测产生的不确定度

在相同条件下对同一样品进行重复检测15次,取其平均值作为测量结果。考虑微生物检测结果多为偏态分布,因此首先将测量结果转换为对数,具体结果见表1。

表1 15次霉菌和酵母菌总数检测结果
Tab.1 Results of the counting of mold and yeast

根据表1的检测结果,计算样品重复检测产生的不确定度:

2.2.4 向培养基加样时引入的不确定度

用1 mL无菌移液器吸取1 mL样液加入1个灭菌平皿内。根据JJG 646-2006《中华人民共和国国家计量检定规程移液器》规定:23 ℃时1 000 μL可调移液器,容量允许误差为±1.0%,假定为三角形分布,1 mL移液器20 ℃时吸取1 mL的不确定度:

2.3 乳液中霉菌和酵母菌计数的合成不确定度

2.4 乳液中霉菌和酵母菌计数的扩展不确定度

取置信概率 p=95%,自由度 v =15-1=14,由t分布表可得k=2.145,于是 U=k×U(合成)=2.145×0.034 27=0.073 509≈0.07。所以:lg X=2.54±0.07,也就是:2.47≤ lg X≤2.61,293≤X≤413。

2.5 结果报告

试验中对培养基、生理盐水、移液管、吸管、三角瓶等做了相应的空白验证,并对无菌室空气做了沉降验证试验,结果皆为0。影响霉菌和酵母菌计数测定结果不确定度的因素很多,试验中除了上述不确定度之外,还有样品保存条件、培养基质量、培养条件(温湿度)、培养时间等方面引起的不确定度。试验主要分析样品取样、样品稀释、样品加样体积、重复性对测量不确定度的影响。故试验乳液中霉菌和酵母菌计数的不确定度报告结果为2.9×102~4.1×102 CFU/g。

3 结论

化妆品中霉菌和酵母菌总数检测结果直接关系到产品的合格与否,《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定:霉菌和酵母菌总数的限值为≤100 CFU/g(或CFU/mL)。检测结果的准确性和可靠性一直是实验室比较关注的质量问题。化妆品中霉菌和酵母菌总数检测主要过程中未涉及到仪器设备进行测量,所以其主要误差来源于实验人为操作的随机误差。霉菌和酵母菌总数检测过程中为了减少样品检测结果的分散性,整个试验由同一位实验人员对同一批次的乳液样品进行15次重复检测,每次检测从样品称量、稀释、倾注平板过程均尽量在15 min内完成,倾注后的虎红平板在凝固后尽快倒置培养,防止菌落在培养基表面蔓延生长。样品稀释过程中使用均质器等将样品与稀释液充分均质后再使用,防止部分菌落集结成一簇菌落团,从而导致平板上生长的菌落数低于实际菌落数。分析不确定度来源时将存在的因素集合后,依次分析,在一定条件下,考虑主要的不确定度贡献者,贡献极细微的因素可忽略不计[9]。通过对化妆品霉菌和酵母菌总数测量不确定度的评价来客观地反映实验室检测结果的有效性和可靠性,从而评价微生物实验室的检测质量。

参考文献:

[1] 国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示:JJF 1059.1-2012 [S].北京:中国计量出版社,2012.

[2] 中国国家标准化管理委员会.检测和校准实验室能力的通用要求:GB/T 27025-2008 [S].北京:中国科学出版社,2008.

[3] 中国合格评定国家认可委员会.检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明:CN1S-CL 09:2013 [S].北京:中国科学出版社,2013.

[4] 徐良,步平.化妆品防腐技术概述[J].中国化妆品,2006(5):80-86.

[5] 国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范[S].北京:中国科学出版社,2015.

[6] 中国计量科学研究院.中华人民共和国国家计量检定规程 电子天平:JJG1036-2008 [S].北京:中国计量出版社,2008.

[7] 中国计量科学研究院.中华人民共和国国家计量检定规程常用玻璃量器:JJG196-2006 [S].北京:中国计量出版社,2006.

[8] 中国计量科学研究院.中华人民共和国国家计量检定规程移液器:JJG646-2006 [S].北京:中国计量出版社,2006.

[9] 曹宏燕.分析测试中测量不确定度及评定:第一部分测量不确定度概述[J].冶金分析,2006,25(1):77-81.

Uncertainty evaluation of the counting of mold and yeast in cosmetics

WU Wei-ling1,2, WANG Rong1,3, GE Qing-ying1,3, YAO Si-ting1,3, ZHU Zhen-hua1, JU Hui-ping1,3
(1.Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Suzhou, Jiangsu 215104, China; 2.Suzhou World Standard Testing Technology Co., Ltd., Suzhou, Jiangsu 215104, China; 3.Suzhou Huabo Daily Chemicals Testing Service Co., Ltd., Suzhou, Jiangsu 215104, China)

Abstract: To ensure the accuracy of the testing results of mold and yeast in cosmetics, according to Safety and Technical Standards for Cosmetics 2015, the uncertainty of the counting of mold and yeast in cosmetics was evaluated.The results show that the expanded uncertainty of measurement is 0.07.When the testing result of mold and yeast in cosmetics is expressed by the parallel for average value,the value range is 2.54±0.07.The uncertainty evaluation of measurement can be applied to evaluate the safety of the cosmetics.

Key words: cosmetics; mold; yeast; uncertainty of measurement; lotion

(本文编辑 张 静)

中图分类号:TQ658

文献标识码:A

文章编号:1006-7264(2018)05-0037-04

DOI:10.13222/j.cnki.dc.2018.05.008

收稿日期:2017-12-22

作者简介:吴卫玲(1987-),女,江苏人,工程师,硕士。