UPLC-MS/MS法检测祛痘类化妆品中7种抗生素

郝 刚

(苏州市药品检验检测研究中心,江苏 苏州 215104)

摘 要: 采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术(UPLC-MS/MS)建立了祛痘类化妆品中7种抗生素(甲硝唑、盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素)的检测方法。待测样品经超声提取、过滤稀释后,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,BEH-C 18 色谱柱上梯度分离,经一级、二级质谱扫描及多重反应监测(MRM)进行定性、定量分析。所建方法中,各待测组分保留时间均在2 min内,检出限为0.1~1.0 ng/mL,平均加样回收率为85.8%~98.5%,精密度为0.9%~3.8%。用于200批祛痘类化妆品的检测,其中9批样品检出甲硝唑和(或)氯霉素。

关键词: 祛痘类化妆品;抗生素;超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用

抗生素类药物对痤疮具有一定的治疗效果,因此某些不法生产企业在化妆品中添加抗生素类药物,从而达到该类产品快速杀菌的效果 [1] 。长期使用含抗生素的化妆品,不仅会产生药物依赖,出现皮肤色素沉着、皮炎等副作用,还会造成人体免疫力下降 [2,3] 。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中明确将抗生素类药品列为化妆品禁用物质,并采用高效液相色谱法(二极管阵列检测器)对甲硝唑、盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素等7种化妆品中常见添加的抗生素类药物进行检测 [4] 。实际工作中发现,该方法分析时间长,灵敏度不高,对于基质复杂的化妆品,待测物质分离效果差,专属性不强,本研究基于UPLC-MS/MS技术建立了祛痘类化妆品中常见7种抗生素的快速定性定量检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

盐酸美满霉素对照品,Sigma(BCBL1427V);二水土霉素对照品,Acros(A0299933,含量:95%);盐酸四环素对照品(批号:130555-200602,含量:97.5%)、盐酸金霉素对照品(批号:130489-200202,含量:95.3%)、盐酸多西环素对照品(批号:0485-9901,含量86.0%)、氯霉素对照品(批号:130555-200602,99.4%)、甲硝唑对照品(批号:100191-200606,含量:99.9%),中国食品药品检定研究院;实验用水为超纯水,其他试剂均为色谱纯。

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪,电喷雾离子源(ESI),Masslynx 4.1数据处理系统,Thermo 低温离心机,KQ-300DA型数控型超声波清洗器,MILLIPORE纯水仪,Heidolph涡旋振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液

精密称取对照品适量,分别用甲醇溶解配制成质量浓度约为1 mg/mL的对照品储备液;甲醇稀释对照品储备液至约10 ng/mL,作为对照品溶液进样分析。

1.2.2 样品前处理

市售200批祛痘类化妆品作为供试品,每批供试品精密称取约1 g样品置于10 mL具塞比色管中,加入甲醇-0.5%甲酸水溶液(体积比1∶1)的混合溶液至刻度,涡旋振荡1 min,超声提取30 min,依样品澄清度用甲醇分别稀释10~100倍,0.22 μm滤膜过滤,取滤液12 000 r/m离心10 min,精密吸取上清液进样分析。

1.2.3 色谱条件

BEH-C 18 色谱柱(2.1 mm ×50 mm,1.7 μm)。采用梯度洗脱,水相(A)为0.1%甲酸水溶液,有机相(B)为乙腈,洗脱条件见表1。流速0.3 mL/min,柱温:30 ℃;进样器温度:15 ℃;进样量:1 μL。

表1 色谱分离条件
Tab.1 Chromatographic separation conditions

1.2.4 质谱条件

除氯霉素采用ESI-离子化方式外,其他6种化合物均采用ESI+离子化,毛细管电压均为0.5 kV,锥孔电压均为30 eV,脱溶剂气温度均为500 ℃,脱溶剂气流速均为1 000 L/h,Daughter Scan二级扫描范围均为50~600 Da。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

分别将7种抗生素对照品储备液用甲醇稀释成100 ng/mL的对照溶液,通过直接进样法进行质谱条件优化。采用一级质谱扫描方式得到各化合物准分子离子峰,在确定准分子离子的基础上进行锥孔电压优化,得到各化合物的最佳锥孔电压;通过Daughter Scan扫描模式,对各种化合物的分子离子进行二级碎片离子扫描,每种化合物选择2~3个特征碎片离子作为检测离子,用于化合物定性判断依据,实验结果如图1所示,各化合物碰撞能及MRM检测条件如表2所示。

表2 MRM质谱检测参数
Tab.2 MS parameters for MRM

图1 各化合物二级质谱扫描图
Fig.1 Daughter scan of 7 standards

续表

2.2 线性关系与检出限

分别取7种抗生素对照品储备液,混合,甲醇稀释至1,5, 10, 20, 50, 100 ng/mL得到混合标准溶液,按1.2.3色谱条件及1.2.4质谱条件进样分析。在所建检测方法下,7种抗生素对照溶液的MRM色谱图如图2所示,保留时间均在2 min内,由于选择不同离子通道进行MRM检测,各化合物出峰互不干扰,专属强。以各组分质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,7种抗生素的线性范围及相关系数见表3。用甲醇稀释对照品溶液,以信噪比(S/N)为3时对应的浓度为检出限,7种抗生素检出限均在0.1~1.0 ng/mL。

2.3 回收率与精密度

空白化妆品基质中分别加入7种抗生素的混合标准溶液,加标量分别为10 ng/g和100 ng/g,每个加标浓度配制3份,按1.2.2 样品前处理及所建液相色谱及质谱条件重复测定6次,计算回收率及精密度,结果见表4。由表4可知,7种抗生素的平均加样回收率为85.8%~98.5%,精密度为0.9%~3.8%。

图2 混合对照品溶液的MRM色谱图
Fig.2 Chromatograms of 7 standards in MRM mode

表3 7种抗生素保留时间、线性范围及检出限
Tab.3 Retention time, detection limits and correlation coefficients of the method

表4 方法回收率和精密度
Tab.4 Recovery rates and RSD of the method

2.4 实际样品检测

用本实验所建方法对笔者单位承担的200批祛痘类化妆品非法添加抗生素进行检测,其中3批化妆品检出甲硝唑,4批化妆品检出氯霉素,另有2批化妆品同时检出甲硝唑和氯霉素,抽样检验不合格率为4.5%。

实际工作中发现,《化妆品安全技术规范》(2015年版)中二极管阵列检测器高效液相色谱法 [4] 对上述抗生素检测时,不仅分析时间长(20 min),且由于化妆品基质复杂,干扰严重,通过DAD图谱很难对疑似检出的抗生素成分进行有效确证,容易造成假阳性结果。笔者单位在承担200批祛痘类化妆品非法添加检验时,依据法定检验方法,34批化妆品疑似检出抗生素类成分,而采用液质联用方法检测,其中9批确认检出甲硝唑和(或)氯霉素,避免了假阳性的检验结果。

液质联用技术近年来在药品、食品、化妆品质量标准中得到广泛的应用 [5,6] ,尤其超高效液相色谱与三重四级杆质谱联用技术,不仅具备分离能力强,分析时间短的特点,还能同时提供待测化合物一级、二级质谱信息,大大提高对待测化合物筛查的准确性,且相比于其他分析方法灵敏度更高,尤其适合保健食品、化妆品中非法添加化学成分的定性、定量检测研究 [7-9]

3 结论

本实验基于UPLC-MS/MS技术,建立了祛痘类化妆品中7种常见抗生素的定性、定量检测方法。所建方法专属性强,分析时间短,7种待测抗生素保留时间均在2 min以内,检出限在0.1~1.0 ng/mL,灵敏度高,平均加样回收率均在85.8%~98.5%,精密度RSD均在0.9%~3.8%。

参考文献:

[1]吴大南,郑和辉,杨丽华,等.祛痘除螨类化妆品中检出抗生素情况的调查[J].中国卫生检验杂志,2006,16(2):216-232.

[2]钟嶷,罗晓燕,郭重山,等.化妆品中抗生素和防腐剂含量的研究[J].环境与健康杂志,2007,24(6):440-442.

[3]董益阳.化妆品检测指南[M].北京:中国标准出版社,2010:170-171.

[4]国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范[S].2015:272-273.

[5]李晓东,林琳,丁丽霞.液质联用技术在药品质量控制中的应用 [J].中国药师,2010,13(5):645-650.

[6]郝刚.液质联用技术在2015版《中国药典》中的应用 [J].中国药品标准,2017,18(3):171-174.

[7]刘华良,李放,杨润,等.超高效液相色谱-串联质谱法分析化妆品中的常见抗生素及甲硝唑[J].色谱,2009,27(1):50-53.

[8]刘颖,张帆,常艳,等.液质联用检索数据库技术快速检测祛痘类化妆品中的17种添加药物[J].药物分析杂志,2017 (9):1693-1700.

[9]郝刚,顾炳仁.UPLC-MS/MS法快速检测减肥类保健食品中5种非法添加化学成分[J].中国医药科学,2014(4):106-109.

Determination of seven antibiotics in anti-acne cosmetics by UPLC-MS/MS

HAO Gang
(Suzhou Institute For Drug Control, Suzhou, Jiangsu 215104, China)

Abstract: The UPLC-MS/MS method for determination of seven antibiotics including oxytetracycline dihydrate, tetracycline hydrochloride, minocycline hydrochloride, chlorotetracycline hydrochloride, doxycycline hydrochloride, chloramphenicol and metronidazole in anti-acne cosmetics was established.Cosmetic sample was extracted by methanol-water containing 0.1 mol/L formic acid.The extracted sample was analyzed using MS scan, Daughter scan and MRM model.These seven analytes can be separated and detected in 2 min.The detection limits are 0.1~1.0 ng/mL, and the recovery rates are 85.8%~98.5% with RSD of 0.9%~3.8%.The method has been applied to determine the antibiotics in 200 real samples from market, in which metronidazole and (or) chloramphenicol have been detected in 9 batches of samples.

Key words: anti-acne cosmetics; antibiotics; UPLC-MS/MS

作者简介: 郝 刚(1984-),男,天津人,副主任药师,博士。

基金项目: 苏州市产业技术创新专项(应用基础研究·医疗卫生)(SYS201583)

收稿日期: 2018-02-18

DOI: 10.13222/j.cnki.dc.2018.09.007

文章编号: 1006-7264(2018)09-0026-04

文献标识码: A

中图分类号: TQ658

(本文编辑 张 静)